OSID：
随着消费者健康意识的不断提高,低醇(酒精度小于7%vol)果酒以其特有的色泽、香气及营养价值,不仅满足了人们多元化的饮酒需求,同时还可避免摄入过量酒精造成的潜在危害,备受年轻消费者的青睐。早酥梨栽培适应性较强,广泛种植于我国华东、西南、西北及华北大多数地区[1]。果实富含多种维生素、矿物质和酚类化合物,但由于采时机械损伤和采后的生理变化,其在贮藏过程中容易出现品质劣变,不能充分体现经济和社会效益[2]。果酒酿造是延伸果品产业链和提高附加值的重要途径之一。然而,目前国内利用早酥梨生产果酒的研究相对较少,且纯梨酒香气寡淡、色泽轻弱、口感质量较差,影响了消费者的接受程度和选择意愿。
香气是评价果酒品质优劣的重要依据,也是体现不同产品之间风格特征差异的主要呈现方式[3]。近年来的研究显示,将不同水果原料复配对提高果酒风味、色泽和营养价值具有积极作用[4-5]。此外,采用非酿酒酵母(non-Saccharomyces cerevisiae)菌株与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,S.cerevisiae)进行混菌发酵对果酒的香气也有显著影响。文献[6]发现美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima,M.pulcherrima)Mp346与S.cerevisiae ES488混菌发酵显著增加了早酥梨酒中酯类和高级醇类化合物含量。文献[7]的研究结果显示,M.pulcherrima与S.cerevisiae顺序接种混菌发酵增加了李子酒中酯类和萜烯类物质含量,产生了令人愉快的果香。文献[8]对麦芽汁、火龙果、葡萄、菠萝组合的复合果汁,通过果酒酵母(S.cerevisiae)和异常维克汉姆酵母混菌发酵,显著提高了酒体中乙酸乙酯及高级醇类化合物的含量,赋予复合果酒独特风味。文献[9]发现S.cerevisiae RW与汉逊德巴利酵母混菌发酵显著增加了枸杞黄精复合果酒中酯类物质含量,为复合果酒带来热带水果和花香。
此外,越来越多的研究表明,源自酵母的细胞壁提取物、甘露糖蛋白和改性后的水溶性β-葡萄糖等多糖成分,可以作为发酵促进剂或品质改良剂,对解决果酒酿造中可能出现的低品质、易变质、耗时长等问题具有积极贡献[10-13]。文献[14]发现,发酵前适量添加酵母多糖可使荔枝酒色泽淡黄,澄清透明,果香酒香协调,口感醇厚,圆润丰满,典型性明显。文献[15]研究表明添加甘露糖蛋白可以抑制花色苷含量下降,降低蓝莓酒酸度,改善口感。整体而言,采用S.cerevisiae和非酿酒酵母混菌发酵复合果酒,以及在酿造过程中添加适宜的酵母多糖已成为提高酒体品质的研究热点[16]。然而,目前国内外对酵母多糖的相关应用研究主要集中于葡萄酒生产中,其对发酵型果酒的色泽稳定性、香气品质和感官特征等相关研究还十分欠缺。
本文以课题组前期建立的早酥梨-美乐桃红低醇果酒的相关研究成果为基础[17],在酒精发酵前添加不同酵母多糖,采用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)和模糊数学评价法,综合分析探讨不同酵母多糖对早酥梨-美乐低醇复合果酒色泽稳定性、香气和感官品质的影响,旨在为提高早酥梨-美乐低醇复合果酒的品质提供理论依据。
早酥梨,购于甘肃景泰条山生态农场,还原糖质量浓度68.60 g/L,pH值为4.05,总酸质量浓度为2.25 g/L。
美乐酿酒葡萄,2022年9月采自甘肃莫高葡萄种植基地,还原糖质量浓度201.45 g/L,pH值为3.58,总酸质量浓度为6.58 g/L。
酿酒酵母菌株ES488,购于意大利Enartis公司。
美极梅奇酵母(M.pulcherrima 346)菌株Mp346,购于法国Lallemand公司。
酵母多糖: MP 60(酵母甘露糖蛋白质量分数40%)、CW 101(酵母细胞壁,甘露聚糖约占30%,β-葡聚糖约占30%)和SG 90(水溶性β-葡聚糖质量分数85%),均购于安琪酵母股份有限公司。
正辛醇、苯乙醇、异戊醇、乙酸乙酯、乙酸己酯、乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等香气物质标准品和2-辛醇均为色谱纯,购于美国Sigma公司。
硫酸铜、氢氧化钠、酒石酸钾钠、无水葡萄糖、磷酸氢二钠均为分析纯,购于天津市光复精细化工研究所;柠檬酸、碳酸钙均为食品级(一级),购于河南万邦实业有限公司;果胶酶为分析纯,购于上海源叶生物科技有限公司。
DF-101S型恒温加热磁力搅拌器,郑州市亚荣仪器有限公司;TRACE 1310-ISQ型气相色谱-质谱联用仪、Genesis 10s型紫外可见分光光度计,美国Thermo Scientific公司;SHH·W21·600S型恒温水浴锅、SPX-150-Ⅱ型生化培养箱,上海跃进医疗器械有限公司;pHS-3C型精密pH计,上海雷磁仪器厂;固相微萃取装置、50/30 μm型萃取头,美国Surpelco公司;H2050R型台式冷冻离心机,长沙湘仪离心机有限公司。
1.3.1 酿造工艺
参照文献[17]方法,具体工艺为:
美乐葡萄汁制备工艺:分选、除梗→破碎(加入60 mg/L SO2、20 mg/L果胶酶)→浸渍24 h(8℃)→皮渣分离→美乐葡萄汁。
早酥梨汁制备工艺:挑选、清洗→切块、去核→护色(1 000 mg/L柠檬酸溶液中浸泡)→榨汁(加60 mg/L SO2)→酶解(加入60 mg/L果胶酶,40℃条件下酶解3 h)→过滤→早酥梨汁。
早酥梨-美乐低醇复合果酒发酵工艺:早酥梨汁、美乐葡萄汁以体积比50∶50复配→成分测定及调整(初始pH值采用柠檬酸或者碳酸钙调节)→加入酵母多糖→接种酵母(接种前需对酵母进行活化,先接种0.2 g/L的非酿酒酵母Mp346,48 h后再接种0.2 g/L的酿酒酵母ES488)→20℃下进行酒精发酵直至发酵结束(残糖质量浓度小于4 g/L)→放置于4℃恒温培养箱使酵母及果渣完全沉淀→倒罐→离心过滤,于4℃冰箱储藏。
1.3.2 菌株活化
按产品说明书推荐方法进行酵母菌株活化。
S.cerevisiae菌株:称取适量ES488活性干粉溶于10倍体积的蒸馏水中,37℃恒温水浴15 min,再添加等体积的复合果汁,25℃恒温水浴15 min。
M.pulcherrima 346菌株:称取适量Mp346活性干粉溶于10倍体积的蒸馏水中,28℃恒温水浴20 min,再添加等体积的复合果汁,25℃恒温水浴15 min。
1.3.3 发酵动力学监测
参照文献[14]的方法,并稍做修改。在2 L的早酥梨、美乐葡萄混合果汁(2.5 L棕色罐)中,分别添加0.25 g/L的MP 60、SG 90和CW 101,摇匀,以不添加酵母多糖的处理组为对照(CK),每隔24 h取样测定还原糖含量和酒精度,绘制发酵动力学曲线。每组试验重复3次,下同。
1.3.4 理化指标检测
酒精发酵结束后取样,参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定果酒的理化指标(pH值以及挥发酸含量、残糖量、总酸含量、总酚含量),按照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中推荐的方法测定果酒酒精度。
1.3.5 颜色指标测定
1.3.5.1 CIELab颜色参数测定
参照文献[18]的方法,并稍作修改。酒样经0.45 μm滤膜过滤后,分别测定其在420、520、620 nm处的吸光度。以蒸馏水作为空白对照,建立CIE颜色坐标系,计算各供试酒样的CIELab颜色参数。每个酒样重复测定3次。
计算公式为
L*=116(Y/Y0)1/3-16
(1)
a*=500[(X/X0)1/3-(Y/Y0)1/3]
(2)
b*=200[(Y/Y0)1/3-(Z/Z0)1/3]
(3)
C*=(a*2+b*2)1/2
(4)
H*=arctan(b*/a*)
(5)
ΔE*=[(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2]1/2
(6)
式中 L*——酒样明暗程度
a*——酒样红绿色程度
b*——酒样黄蓝色程度
C*——酒样色彩饱和度
H*——色调角,(°)
ΔE*——色差
X、Y、Z——样品三刺激值
X0、Y0、Z0——D65标准白光三刺激值,分别取97.29、100.00、116.14
1.3.5.2 色度-色调测定
参考文献[19]的方法,并稍作修改。吸取1 mL酒样,用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释10倍,之后在420、520、620 nm下测定吸光度,三者之和为酒样的色度,前二者吸光度之比即为色调值。
1.3.5.3 总花色苷含量测定
参照文献[20]的方法,采用pH示差法测定。
1.3.6 挥发性香气物质检测
挥发性成分分析参照文献[6]的方法,并略作修改。
1.3.6.1 香气成分富集
在15 mL顶空瓶添加2.4 g NaCl、8 mL待测酒样和10 μL 81.06 mg/L 2-辛醇,加磁力搅拌转子,于40℃恒温加热磁力搅拌器水浴平衡30 min,再插入萃取针萃取30 min富集香气成分。
1.3.6.2 GC-MS条件
GC-MS条件:毛细管色谱柱DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm),载气为氦气,流速为1.0 mL/min;气相色谱进样口(240℃)进样5 min;采用以下升温程序:40℃保持5 min,以3.5℃/min升至180℃并保持15 min;传输线温度保持在230℃,离子源温度250℃,不分流进样。电子轰击离子源(EI)温度250℃;电子能量70 eV;连接杆温度180℃;扫描范围30～350(质荷比)。
定性定量分析:通过NIST-11、Wiley及香精香料谱库对未知挥发性香气化合物质谱图进行检索比对,结合人工图谱解析确认各挥发性香气物质化学成分,进行定性分析。对已有标准品的香气化合物,通过标准曲线(R2>0.995)进行定量,其他无标准品的化合物采用化学结构和官能团相似、碳原子数相近的标准物质进行半定量。
1.3.7 模糊数学感官评价
1.3.7.1 模糊数学方法建立
参考文献[21]的方法,并略作修改。对于早酥梨-美乐低醇复合果酒,有4项指标(外观、香气、滋味、典型性)决定其感官品质,即因素集U={U1,U2,U3,U4}。对每个因素的评价按优、良、差3个等级评价,则评语集V={V1,V2,V3}。
1.3.7.2 权重集确定
通过调查20名食品相关专业的学生(10男,10女,均无任何身体缺陷),将各指标分别与其他3项指标进行比较,认为该指标相较于其他3项指标更重要者记为1,否则为0。通过计算即得到各个指标权重,权重集合为Q,Q={Q1,Q2,Q3,Q4}。
1.3.7.3 模糊评价
由感官评定小组(5男,5女),参照文献[22]方法对每个样品进行感官评价(表1),统计各等级票数,将其除以总票数得到评价矩阵A,则第i个样品的感官因素模糊数学综合评价结果Yi=QAi。
表1 感官品质评价标准
Tab.1 Criteria of sensory evaluation
等级分值外观香气滋味典型性优987澄清透明、无杂质、颜色呈玫瑰红或宝石红,色泽鲜艳具有纯正、优雅、愉悦和谐的果香与酒香酒体丰满,醇厚协调,舒服爽口典型性突出,风格独特、优雅,富有梨和葡萄的独特风味良654透明,有少许沉淀,颜色偏红色,有光泽果香与酒香较少或不怡人酒体协调,纯正无杂有典型性,不够怡雅差321酒体浑浊,有明显杂质,颜色异常,光泽暗淡无果香与酒香,有不良气味酒体单薄,苦涩,有杂味缺少典型性,风格一般
1.3.7.4 感官评分
参照文献[17]方法,将优、良、差3个等级分别赋予各等级分数的中间值,即有评价等级B={B1,B2,B3}={8,5,2}。将模糊评价的综合评价结果分别乘以其对应的分值,并进行加和得出每个样品的感官评分,即综合评分Wi=YiB。
试验数据用Microsoft Excel 2010统计,SPSS Statistics 26.0进行显著性分析(Duncan法,P<0.05),Origin 2021绘制点线图,Graphpad Prism 9.0绘制其他图,利用TBtools进行热图聚类分析,SIMCA 14.1进行正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA),测定均重复3次,结果用平均值±标准差表示。
图1中,CK表示未添加酵母多糖的发酵酒样;CW、SG、MP表示分别添加0.25 g/L CW 101、SG 90和MP 60的发酵酒样。整体分析,CW、SG、MP均对酒精发酵具有一定的促进作用。在酒精发酵前期,CW的促进作用最好,其次为SG和MP。从发酵第4天开始,MP处理组还原糖下降最快,发酵第7天时,还原糖质量浓度为3.02 g/L,低于CK组的3.34 g/L。 在发酵前5 d酒精含量快速增加,5～7 d时酒精含量增速变缓;发酵结束时(第7天),各组酒样酒精含量从大到小依次为MP(6.57%vol)、SG(6.47%vol)、CW(6.30%vol)、CK(6.17%vol)。其中MP处理组酒样残糖最低,酒精度最高,可能是因为酵母甘露糖蛋白提高了酵母细胞生理活性[23]。
图1 不同酵母多糖处理的发酵动力学
Fig.1 Fermentation kinetics of fruit wine treated with different yeast polysaccharide
3种酵母多糖对早酥梨-美乐低醇复合果酒理化指标的影响结果见表2。虽然外源性酵母多糖不同程度地提高了果酒的酒精度,但均符合低醇果酒的标准(<7%vol)。MP处理组果酒中残糖含量显著低于CK(P<0.05)。供试酒样pH值升高,可滴定酸降低,其中MP处理组降酸效果最为显著(P<0.05),但挥发酸含量无显著差异(P>0.05)。3个处理组中,总酚质量浓度分别较对照显著提升17.11%、13.12%、18.83%,且MP处理效果最佳(P<0.05)。
表2 复合果酒基本理化指标
Tab.2 Basic physicochemical indexes of composite fruit wine
注:同一指标不同字母表示差异显著,样本量n=3 (P<0.05),下同。
参数酒样CKCWSGMP还原糖质量浓度/(g·L-1)(3.34±0.01)b3.50c(3.51±0.01)c(3.02±0.01)apH值(3.62±0.01)b(3.64±0.01)ab(3.63±0.01)b3.65a酒精度/%vol(6.17±0.05)a6.30b(6.47±0.06)c(6.57±0.06)d总酸质量浓度/(g·L-1)(5.68±0.02)a(5.43±0.01)ab(5.48±0.01)ab(5.35±0.02)b总酚质量浓度/(mg·L-1)(584.33±0.01)a684.33b(661.00±0.01)b(694.34±0.02)b挥发酸质量浓度/(g·L-1)0.42a(0.41±0.01)a(0.42±0.01)a(0.42±0.01)a
供试酒样颜色指标的测定结果见表3。CIELab参数中,L*与果酒的颜色深浅成反比,L*越低,酒样颜色越深。a*>0与红色相关,a*<0与绿色相关,a*越高说明酒体颜色中红色分量越大。b*>0与黄色相关,b*<0与蓝色相关,b*越高说明酒体颜色中黄色分量越大。酒精发酵结束后,MP处理组酒样L*值(68.41±0.04)显著低于其他处理组和CK(P<0.05),说明MP处理组酒样颜色更深。此外,MP处理组酒样a*、b*均高于CK,且a*值相较于对照显著提升12.51%,由此也相应地使MP处理组酒样的C*显著增高,颜色更纯正。H*表示色调角,红色为0°(360°);黄色为90°;绿色为180°;蓝色为270°。MP处理酒样H*值较对照呈下降趋势,且趋于0,表明其红色程度更深。色差ΔE*与L*、a*和b*贡献程度有关,表征酒样间总体差异程度。以CK为参比酒样,CW和SG均表现为ΔE*大于1,而MP表现为ΔE*大于4,说明添加MP对色差影响显著(P<0.05)。
表3 酒样颜色指标
Tab.3 Color indexes of composite fruit wine
参数酒样CKCWSGMPL∗(70.54±0.13)b(70.70±0.77)b(71.49±0.10)a(68.41±0.04)ca∗(31.58±0.18)b(31.96±0.83)b(30.67±0.13)c(35.53±0.02)ab∗(6.69±0.11)b(6.41±0.13)c(7.18±0.03)a(6.78±0.01)bC∗(32.28±0.18)bc(32.59±0.83)b(31.50±0.13)c(36.17±0.02)aH∗/(°)0.21b0.20c0.23a0.19dΔE∗0c(1.20±0.27)b(1.42±0.34)b(4.49±0.22)a色度(3.16±0.13)b(3.25±0.01)b(3.13±0.05)b(3.43±0.02)a色调值(0.73±0.01)ab0.72b0.74a(0.64±0.01)c总花色苷质量浓度/(mg·L-1)(120.01±1.33)c(133.75±0.41)b(120.83±0.61)c(142.21±0.54)a颜色表征
果酒中酚类物质(花色苷、单宁等)含量越高,酒体颜色越深,色度也越高。MP处理酒样总花色苷质量浓度((142.21±0.54) mg/L)显著高于CK和其他处理酒样(P<0.05),这是由于酵母多糖结合了单体花色素,相互作用形成色素聚合物,阻止了部分色素的聚集沉淀[24]。MP处理酒样的色调值(0.64±0.01)显著低于CK(P<0.05),酒体颜色更红。然而,在CW和SG处理酒样中没有观察到类似结果,尽管CW处理酒样C*和色度高于CK酒样,但差异不显著(P>0.05)。上述结果更直观的颜色表征见表3。
果酒的香气特征是不同挥发性化合物共同作用的结果。外源添加酵母多糖早酥梨-美乐低醇复合果酒中主要香气物质的GC-MS检测结果如图2(图中***表示P≤0.001,**表示0.001<P≤0.01,*表示0.01<P≤0.05,ns表示P>0.05)所示。试验共检测出74种香气化合物,其中酯类30种、高级醇类14种、脂肪酸类8种、苯衍生物4种、羰基化合物4种、挥发性酚类5种、萜烯及其他类9种,总质量浓度达到7 999.06～11 287.90 μg/L。但各组酒样中挥发性化合物的种类及含量均有差异。
图2 不同处理组酒样的挥发性香气物质
Fig.2 Volatile aroma substances of fruit wine treated with different yeast polysaccharide
高级醇是酒精发酵过程中形成的主要次级代谢产物之一,其质量浓度低于300 000 μg/L时可以增加香气复杂性,赋予果酒怡人的花香和水果香;当质量浓度高于400 000 μg/L时会给果酒带来刺鼻的气味[25]。供试酒样中共检测到14种高级醇类物质,质量浓度由高到低依次为MP(2 979.11 μg/L)、CW(2 908.40 μg/L)、SG(2 751.13 μg/L)、CK(2 548.47 μg/L);MP、CW、SG酒样中高级醇质量浓度分别是对照的1.17、1.14、1.08倍(图2a),其中异丁醇、正己醇、正辛醇、异戊醇等的质量浓度均明显增加(P<0.05),可为果酒带来独特的醇香味。
乙酸酯、脂肪酸乙酯等酯类物质具有愉悦的花香和果香味,是果酒香气中的重要组成部分[26]。试验共检测出30种酯类物质(7种乙酸酯,14种脂肪酸乙酯,9种其他酯),质量浓度总量为3 590.67(CK)～5 482.54 μg/L(MP)。乙酸酯质量浓度从高到低依次为MP(2 569.62 μg/L)、SG(2 175.38 μg/L)、CW(1 913.76 μg/L)、CK(1 696.09 μg/L),其中MP处理组酒样中质量浓度是CK的1.52倍(图2b),主要是由乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯和乙酸己酯的质量浓度显著增加所致。CW、SG、MP处理组中脂肪酸乙酯质量浓度较CK分别显著增加22.17%、30.38%、53.20%(P<0.05)(图2c),其中各处理组中辛酸乙酯、己酸乙酯和癸酸乙酯的质量浓度最高,尤其是辛酸乙酯质量浓度比CK分别提升21.35%、35.15%、53.00%。其他酯类物质质量浓度占酯类化合物总量的2.37%～4.46%,且与CK相比,只有MP处理组质量浓度显著增加(图2d)。
脂肪酸类化合物含量接近阈值时,果酒会产生果味、奶酪味、黄油味。但浓度过高会产生汗味、脂肪味[27]。CK、CW、SG、MP试验组共检出8种脂肪酸类物质,质量浓度依次为432.67、386.64、361.67、358.49 μg/L,其中辛酸的质量浓度比对照组降低3.71%～14.00%,有利于减轻果酒中不良气味。与CK相比,CW、SG、MP处理组的脂肪酸质量浓度分别显著降低10.64%、16.41%、17.14%,但各处理组之间不存在显著差异(P>0.05)(图2e)。
试验中还检测到4种苯衍生物、4种羰基化合物、5种挥发性酚类化合物。苯衍生物可赋予果酒花香和果香[17],CW、SG、MP各处理组酒样中质量浓度均显著高于CK(图2f),尤其是苯乙醇质量浓度最高,较CK显著提升64.03%、59.84%、77.04%。羰基化合物、挥发性酚类物质虽然质量浓度较低,但与其他氧化物结合时,可以增强果酒的发酵香气[28]。
赋予果酒花香、果香特性的萜烯类化合物感官阈值较低,是果酒中重要的香气物质[29]。供试酒样中共检测出芳樟醇、香茅醇、橙花醇、香叶醇、香叶基丙酮5种萜烯类物质,CW、SG、MP处理组萜烯类物质质量浓度较CK显著增加85.41%、79.80%、88.76%(图2i),尤其是香茅醇、香叶醇质量浓度显著增加(P<0.05)。此外,还检测到大马士酮、叔十六硫醇、3-甲硫基-1-丙醇和水杨酸甲酯,尽管这些物质质量浓度较低,但对酒体香气复杂性有一定贡献。
为了可视化不同酵母多糖处理对早酥梨-美乐低醇复合果酒酒样中挥发性香气化合物的总体影响,对不同酒样中所检测香气化合物进行聚类分析,结果如图3所示。从整体分析,不同处理组酒样被聚为两大类,CK单独聚为一类,即不同酵母多糖处理组与CK组之间均存在显著差异(P<0.05)。MP处理组与SG处理组虽聚为一类,但MP酒样红色区域占比约为2/3,SG酒样约为1/2,MP处理组酒样中不同种类挥发性香气化合物总量显著高于SG处理组酒样。
图3 不同处理酒样中挥发性香气化合物热图聚类分析
Fig.3 Heatmap cluster of aroma compounds in fruit wine treated with different yeast polysaccharide
2.5.1 差异香气物质筛选
以各酒样中共检测出74种挥发性香气化合物作为因变量,不同处理作为自变量,通过OPLS-DA,可以实现4个处理的早酥梨-美乐低醇复合果酒样品有效区分(图4a)。本次分析中的自变量拟合指数
为0.896,因变量拟合指数
为0.990,模型预测指数Q2为0.964,均大于0.5,表示模型拟合结果可接受[30]。经过200次置换检验,如图4b所示,Q2回归线与纵轴的相交点小于0,说明模型不存在过拟合,模型验证有效,认为该结果可用于不同处理之间挥发性香气化合物差异分析。
图4 不同处理酒样中挥发性香气化合物OPLS-DA分析和模型交叉验证结果
Fig.4 OPLS-DA analysis of volatile aroma compounds in different yeast polysaccharide treated wine samples and model cross validation results
变量重要性投影值(VIP值)是OPLS-DA模型变量的权重,VIP值越大,代表该物质对区分不同处理组之间的差异作用越关键[31]。对OPLS-DA模型分析VIP值大于1(图5)的34种差异挥发性化合物进行热图分析,结果如图6所示。与CK相比较,SG处理组对香茅醇、香叶醇、1-壬醇、2-十六醇、乙酸苯乙酯、壬酸乙酯和丁酸丁酯等差异香气物质有促进作用;CW处理组明显改变了香茅醇、香叶醇、正己醇、(Z)-3-己烯-1-醇、2-乙基己醇、2-壬基醇、2,3-丁二醇、1-壬醇、2-十六醇和乙酸己酯等差异香气物质含量;MP处理组明显提高了香茅醇、香叶醇、正己醇、2-乙基己醇、2,3-丁二醇、1-壬醇、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯、乙酸己酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、7-辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、油酸乙酯、己酸异戊酯、反式-4-癸烯酸乙酯、10-十一烯酸乙酯和丁酸丁酯等差异香气物质含量。2-甲基丁酸、9-癸烯酸、月桂酸、乙酸庚酯、己酸异戊酯含量在各处理中均低于CK。整体分析,除脂肪酸含量有所降低外,各处理组均不同程度促进了萜烯类、高级醇类、酯类差异化合物的生成;CW处理组主要影响高级醇类,MP处理组主要作用于酯类,但MP处理组酒样中主要差异化合物含量和种类均显著高于其他处理组酒样。
图5 酵母多糖处理酒样中挥发性香气化合物VIP值
Fig.5 VIP value of aroma compounds in fruit wine treated with different yeast polysaccharide
图6 不同处理酒样中差异挥发性香气化合物热图分析
Fig.6 Heat map of differential aroma compounds in fruit wine treated with different yeast polysaccharide
2.5.2 关键差异物质香气属性
气味活性值(Odor activity value,OAV)大于1的化合物被认为是样品风味的主要贡献者,OAV 处于0.1～1.0的成分通过加成作用对酒体风味也有重要作用[32]。
为了确定供试酒样的香气属性差异,根据P<0.05、VIP值大于1且OAV大于0.1的标准,筛选出8种关键差异香气物质,包括萜烯类2种、羰基化合物1种、酯类4种、脂肪酸1种,对其进行热图分析。由图7可知,CK酒样中2-甲基丁酸等香气物质质量浓度较高,为果酒带来辛辣、乳酪等香气;CW酒样中香叶醇、香茅醇和癸酸乙酯等质量浓度较高,赋予果酒浓郁的玫瑰、柠檬、柑橘等花果香气;SG酒样中壬醛、香茅醇、香叶醇和乙酸苯乙酯等香气物质质量浓度较高,赋予果酒复杂浓郁的玫瑰、柑橘、柠檬、热带水果等花果香;MP酒样中2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、香茅醇和香叶醇等香气物质质量浓度较高,能够为果酒带来复杂浓郁的蔷薇、玫瑰、柑橘、柠檬、菠萝、草莓、香蕉、苹果、甜果和热带水果等气味。由此表明,添加MP能够明显提升早酥梨-美乐低醇复合果酒中的花香、果香属性,提高香气复杂性。
图7 不同处理酒样中关键差异香气化合物的热图分析
Fig.7 Heat map of key differential aroma compounds in wine treated with different yeast polysaccharide
2.6.1 果酒模糊数学感官综合评价结果
以CK酒样为例,该酒样外观7人评优,2人评良,1人评差(表4),分别占总人数比例为0.7、0.2、0.1,即有:外观U1={0.7,0.2,0.1};同理可得香气U2={0.5,0.3,0.2};滋味U3={0.6,0.3,0.1};典型性U4={0.6,0.2,0.2}。Ai=[U1 U2 U3 U4]T,其中i是样品编号,i=1,2,3,4,即有模糊矩阵
表4 酒样感官评价指数票数统计结果
Tab.4 Statistical results of sensory evaluation index of wine samples
样品外观香气滋味典型性优良差优良差优良差优良差CK721532631622CW820622721820SG631721811910MP910820820811权重0.200.250.350.20
根据权重集Q={0.20,0.25,0.35,0.20},评价结果为Y,Yi=QAi计算各样品评价结果。
同理Y2=[0.715 0.200 0.085];Y3=[0.755 0.165 0.080];Y4=[0.820 0.160 0.020]。
2.6.2 果酒模糊数学感官综合评分
根据综合评分公式:Wi=Yi·B,其中评价等级集B={8,5,2}。W1=[0.475 0.260 0.145]·[8 5 2]T=5.390;同理W2=6.890;W3=7.025;W4=7.400。
由计算结果可知,MP酒样感官评分最高(7.400),CK对照组酒样最低(5.390)。整体而言,酵母多糖处理组酒样更受感官评价员喜爱(表4),且MP酒样色泽饱满,呈现迷人的宝石红、酒体丰满,醇厚协调、具有浓郁的花果香,与关键差异物质香气属性分析结果一致(图7)。
本试验结果表明,外源CW、SG、MP均对酒精发酵有明显的促进作用。文献[23]发现添加甘露聚糖可缩短酵母生长的迟滞期,显著提高细胞活力,促进酵母菌株快速生长和繁殖,与本文结果相似。CW、SG、MP处理组总酚含量分别较CK显著提升17.11%、13.12%、18.83%,表明酵母多糖的添加有利于果酒中酚类物质含量的增加,这可能是由于酵母多糖对果酒中酚类物质的包裹,某种程度上能提高其稳定性和抗氧化性[33]。颜色分析结果表明,在酒精发酵前添加酵母甘露糖蛋白,可以改善早酥梨-美乐低醇复合果酒色泽,在CW和SG处理酒样中没有观察到类似结果。而在葡萄酒类似的研究中,酵母多糖对颜色的影响存在一定的不确定性。有研究表明,多糖和酚类化合物之间相互作用形成了稳定的聚合色素,可以防止或减少葡萄酒的氧化,有助于稳定葡萄酒的颜色[34];相反,也有研究显示,相互作用会造成葡萄酒颜色损失[35]。
香气决定了果酒质量和消费者的喜好程度。本试验中,甘露糖蛋白处理复合果酒酒样中的高级醇、乙酸酯和脂肪酸乙酯质量浓度显著增加(P<0.05)。高级醇在发酵过程主要通过Ehrlich和Harris途径生成[36]。其中,Ehrlich途径是氨基酸通过转氨酶作用生成的酮酸,在脱羧酶作用下脱羧成醛,最终在醇脱氢酶作用下还原为高级醇。而Harris途径是通过丙酮酸脱羧酶、脱氢酶将葡萄糖代谢产生的酮酸经脱羧、脱氢还原成高级醇。酵母甘露糖蛋白处理组中高级醇质量浓度显著高于对照组(P<0.05),可能是因为酵母细胞中ATP酶的活性增强,水解释放了更多的ATP,有利于为Ehrlich途径提供能量[37-39]。乙酸酯是由酵母细胞内酰基转移酶或酯合成酶催化高级醇与乙酰辅酶A缩合而成。酵母甘露糖蛋白作为发酵促进剂,提高了高级醇的质量浓度,由此增加了乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯和乙酸己酯的合成底物,进而促进了乙酸酯的积累[40]。脂肪酸乙酯主要通过酯化反应生成[40],甘露糖蛋白能够增加酵母细胞GSH的含量和ATP酶活性,提高果酒的抗氧化能力,促进酯化反应的进行,进而提高酒样中辛酸乙酯、己酸乙酯和癸酸乙酯的质量浓度[23]。
文献[41]研究发现,添加酵母多糖能显著改变葡萄酒中萜烯类香气化合物的质量浓度,并且不同类型酵母多糖的作用效果有较大差异。本试验中酵母多糖对果酒萜烯类化合物的质量浓度影响较大,CW、SG、MP处理组分别较CK显著增加85.41%、79.80%、88.76%。添加酵母甘露糖蛋白可增加细胞中还原型GSH的合成与释放,迅速结合并清除细胞中氧自由基,从而减少萜烯类等香气物质的降解[23]。此外,酵母甘露糖蛋白还能提高酵母细胞活性及β-糖苷酶活性,分解并释放糖苷态的香气前体物质[42]。文献[43]研究表明,葡萄酒中富含甘露糖蛋白胶体时可以优先吸附保留葡萄酒中的萜烯类和降异戊二烯类香气化合物,使其含量显著增加,与本文结果相似。此外,添加甘露糖蛋白后脂肪酸类化合物质量浓度显著降低,可能是由于多糖物质与挥发性酸类化合物相互作用降低了酸类物质的挥发性[44]。
关键差异香气化合物热图分析结果进一步表明,外源酵母甘露糖蛋白明显促进了关键差异香气化合物2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、香叶醇和香茅醇的生成,为果酒带来复杂浓郁的果香、花香等相关香味属性。相较于普通感官评价,模糊数学对感官评定人员要求相对较低,最大程度避免由评价小组是否经过系统培训、个人喜好以及背景知识差异等因素造成的误差,减少感官评价过程中主观性的干扰。本试验模糊数学感官评价结果显示,酵母甘露糖蛋白处理酒样模糊数学感官综合评分最高,表现出较为浓郁的花果香,与关键差异化合物香气属性分析结果相一致。综合分析,外源添加酵母甘露糖蛋白可改善早酥梨-美乐低醇复合果酒色泽,增加果酒香气浓郁度和复杂性,具有良好的果酒生产增香应用潜力。
3种酵母多糖对早酥梨-美乐低醇复合果酒混菌发酵动力学和品质影响结果表明,外源性甘露糖蛋白可以促进酒精发酵,降低果酒酸度,改善果酒颜色;显著提高酒体中萜烯类、高级醇、乙酸酯、脂肪酸乙酯类香气化合物的含量,增加果酒香气的复杂性,稳定香气成分,提高香气的持久性;模糊数学感官综合评分为7.400,表现出较为浓郁的花果香。综合分析,酒精发酵前添加0.25 g/L酵母甘露糖蛋白,可以改善复合果酒色泽,提高果酒香气品质。
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