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土霉素(Oxytetracycline,OTC)因具有广谱抗病原微生物作用,被广泛用于农业、畜牧业和养殖业[1],而使用后的OTC被母体吸收后,大多数通过动物粪便和尿液排出体外,并通过各种途径进入环境[2-4]。进入环境的OTC容易在土壤中吸附累积,破坏土壤环境的微生物群落,产生抗性基因,存在不可忽视的生态环境风险[5-6];另一方面,吸附于土壤中的OTC会被蔬菜作物吸收,威胁农产品安全[7-8]。因此,实现土壤中OTC的精准检测,对于我国土壤抗生素污染状况监测及早期预警具有重要意义。
土壤中OTC的高效提取是精准检测的前提。现有的土壤OTC提取装置分为实验室用装置和便携式装置2类,其中,实验室用提取装置主要包括体积相对较大的振荡器、超声仪、离心机等仪器,无法满足现场提取需求;商业化的便携提取装置,可以实现土壤OTC的便携式提取,但是功能单一,需要附加具有其他功能的装置,才能满足现场提取的要求。因此,亟待研制一种功能集成的便携式提取装置,用于土壤OTC的现场提取。集成电路技术具有故障率低、功耗小、性价比高、可靠性强等优点[9],为功能集成的土壤OTC提取装置的硬件一体化设计提供了思路。
光电化学(Photoelectrochemistry,PEC)技术具有检测精度高、易于小型化等优势,在土壤OTC的现场检测中具有巨大的应用前景。然而,实验室用PEC检测装置为体积相对较大的氙灯光源和电化学工作站。为了满足PEC检测的现场分析需求,研究者开发了便携式PEC检测装置。例如,SHA等[10]以微型电化学工作站为信号传输装置,实现了尼古丁的现场分析;LI等[11]以发光二极管(Light emitting diode,LED)为激发光源,电化学工作站为信号输出装置,构建了LED驱动的PEC检测平台。上述研究表明,低功率LED和微型电化学工作站为便携式PEC检测装置的研制提供了设备和技术支持。
本文以STM32F103ZET6单片机为控制芯片,基于电子电路技术,研制现场提取-精准检测土壤OTC的便携式装置。提取装置集成电机驱动单元、显示单元、称量单元、电源单元等,完成硬件一体化设计;进一步利用集成电路,设计LED控制系统及光源暗室,并与商业化的U盘型便携式电化学工作站结合,组建可用于土壤中OTC检测的便携式PEC检测装置。最后,进行土壤OTC现场分析试验,以验证装置在实际应用中的可行性。
便携式装置由提取和检测2部分组成,装置的总体设计如图1所示。首先,设计并研制便携式提取装置,实现土壤OTC的现场提取,具体如下:以STM32芯片为主控芯片设计电子电路,驱动无刷直流电机模块(SNR8440M),PWM原理控制无刷直流电机启停,以HX711芯片称取土壤,将土壤与OTC萃取液按照1∶30(质量比)混合后,通过电机和设计的搅拌叶、离心转子,使土壤混悬液搅拌均匀并离心,通过获取离心后的上清液得到土壤提取液,实现土壤OTC的现场提取。然后,基于LED光源、商业化便携式电化学工作站、基于电子电路设计的LED控制电路和3D打印获得的光源暗室,构建便携式PEC检测装置。
图1 装置总体设计
Fig.1 Overall design of device
设计的土壤OTC提取装置要求具有便于携带、提取效率高、续航时间长及显示界面清晰等特点。基于以上要求,该装置需具备的技术指标如下:提取时间小于等于20 min,可同时搅拌和离心,称量精度达mg级,可检测环境的温湿度信息,一次充电可连续工作时间大于等于120 min,装置操作方便快捷以及可清晰显示各项信息,土壤OTC提取精度大于等于90%。装置控制系统组成如图2所示。
图2 提取装置控制系统构成图
Fig.2 Control system of extraction device
微控制器单元通过SPI方式实现与DHT11温湿度传感器通信;通过模数转换器ADC获取HX711称量单元中的土块信息;通过高级定时器控制SNR8440M电机驱动模块,并进一步利用PWM控制原理实现两个电机的启停控制,以完成搅拌、离心过程;最后通过控制器中的FSMC接口实现提取装置控制过程中的人机交互。
提取装置的工作流程如图3所示,取1～300 g的土壤样品放在AT8501传感器上,传感器产生模拟量至HX711芯片,控制芯片通过数模转换器接收土壤的质量信息;将土壤加入烧杯,并按照土壤与萃取液质量比为1∶30与OTC萃取液混合,将混合液搅拌至无明显颗粒物后离心,获得的上清液即为土壤提取液。该过程中的电机通过MCU单元的脉冲宽度调制(Pulse width modulation,PWM)接口控制调速,将PWM信号传入SNR8440M驱动单元中,进而控制双BLDC电机启停;DHT11温湿度传感器将环境中的温湿度信息通过SPI接口传入微控制器单元,通过TFT-LCD显示单元反馈,完成土壤OTC的便携式提取。
图3 提取装置工作流程图
Fig.3 Working flowchart of extraction device
1.2.1 显示电路
显示单元使用ALIENTEK公司的2.8吋TFT-LCD模块。该单元支持65 K色显示,分辨率为320像素×240像素,接口为16位的80并口,显示驱动芯片为ILI9341控制器。ILI9341液晶控制器采用RGB565格式存储颜色数据,且自身带有 172 800 B的显存,所以,TFT-LCD上颜色的读取和写入均通过16根数据线对显存进行读写操作,板载背光电路电压支持3.3 V,同时支持多点触控。TFT-LCD显示电路硬件连接如图4所示。
图4 TFT-LCD显示电路硬件连接图
Fig.4 Peripheral interface circuit of TFT-LCD
1.2.2 称量电路
称量原理是利用电阻应变片式称量传感器测量压力信号,当被称样品放置在秤台时,应变片发生形变,传感器随之产生力-电效应,将样品的质量转换成与被称样品质量呈一定函数关系的模拟电信号。该信号经电路放大、滤波后再由模数转换器转换为数字信号送入MCU处理,将数字信号转换为质量值。运算结果送到内存,需要显示时,MCU发出命令,从内存读出送到TFT-LCD显示器中显示[12]。在整个系统中,A/D转换部分的性能至关重要。HX711是为高精度电子秤设计的24位A/D转换芯片,相较于其他同类芯片,该芯片不仅能降低整机成本,还能提升电子秤性能[13-14]。其外围电路如图5所示,MCU的PC4引脚与DOUT引脚相连,MCU的PC5引脚与SCK引脚相连。
图5 HX711外围接口电路
Fig.5 Peripheral interface circuit of HX711
1.2.3 电源电路
硬件系统采用24 V锂电池为整个控制装置提供稳定的直流电压。24 V电源直接为SNR8440M供电,保证BLDC工作稳定。24 V直流电压经过XL1509整流桥得到5 V电压,5 V电压主要为LM358双运算放大电路、A/D转换芯片、HX711和74HC04D供电,不仅可以为称量单元提供稳定的工作电压,还可增加MCU信号的驱动能力。二级降压芯片ME6209A33PG将5 V电压转换为3.3 V电压,3.3 V电压为MCU、TFT-LCD、DHT11供电。电源单元的电路如图6所示。
图6 24 V转5 V与5 V转3.3 V电源电路
Fig.6 Power supply circuit of 24 V to 5 V and 5 V to 3.3 V
XL1509-5转换芯片具有150 kHz的DC-DC转换器,不需设置其他外部元件,其本身最高负载驱动能力为2 A,平均负载电流为1 200 mA,转换效率高,能够在维持系统内稳定电源供给的同时,具有极好的线性电流输出[15-16]。XL1509-5转换芯片以OUTPUT作为电源开关的输出引脚,便于主控器对电源进行控制,当引脚处于低状态时,电源处于开启状态,反之,处于关闭状态[17]。ME6209A33PG是一组正电压输出、三引脚稳压器,即使在输入/输出电压差很小的情况下也能提供大电流。
1.2.4 便携式提取装置集成及精度验证
以Solidworks三维图形建模软件进行提取装置的系统建模。利用Solidworks中草图模式,绘制装置的各零部件,进一步利用3D打印获得装置实物(图7),其尺寸为:25 cm×11 cm×25 cm。
图7 提取装置实物图
Fig.7 Physical view of extraction device
1.搅拌电机 2.工作电源 3.离心电机 4.称量托盘 5.硬件控制系统 6.搅拌叶 7.离心转子
为了验证装置的提取精度,对比研究了实验室用提取装置(振荡器+超声仪+离心机)和本文研制装置对土壤OTC的提取效果。分别选取3个不同加标浓度(5×10-8、2×10-7、1×10-6 mol/L)的土壤样品,并利用研制装置和实验室装置,以国标GB/T 32951—2016中使用的Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇(1∶1∶2)萃取剂对土壤样品进行提取,并利用国标GB/T 32951—2016的超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)对提取样品进行检测,结果如表1所示。由表1可知,检测结果基本一致,表明两装置对土壤样品OTC提取效率一致。根据GB/T 6379.2—2004中的准确度规定,便携式装置对于土壤中OTC的提取,具有较好的可行性。
表1 不同添加量提取结果对比
Tab.1 Comparison of extraction results by different devices mol/L
添加量研制装置检出量实验室装置检出量5×10-85.1×10-85.50×10-82×10-71.9×10-72.10×10-71×10-69.2×10-71.07×10-6
1.3.1 材料与试剂
OTC标准品(≥98.0%)购买于北京伊诺凯科技有限公司;OTC适配体(序列为5′-GGA ATT CGC TAG CAC GTT GAC GCT GGT GCC CGG TTG TGG TGC GAG TGT TGT GTG GAT CCG AGC TCC ACG TG-3′)购买于生工生物有限公司(上海)。Bi2S3-C3N4采用一步溶剂热反应获得[18]。丝网印刷电极(Screen-printed electrodes,SPE)与U盘型便携式BIOSYS电化学工作站产自深圳刷新生物传感科技有限公司。
1.3.2 PEC适配体传感器构建
由于适配体对目标物识别具有较高的特异性[19],以适配体作为识别元件,以Bi2S3-C3N4为光电转换材料,构建PEC传感界面用于检测OTC。具体构建过程如下:将20 μL Bi2S3-C3N4悬浮液滴涂于SPE的工作电极表面,室温晾干,取20 μL适配体溶液(3 μmol/L)滴涂在Bi2S3-C3N4表面,并在4℃下孵育12 h获得传感器。
1.3.3 LED驱动电路及性能分析
LED驱动电路的主电源电路使用XL4015芯片,其具备较强的电流驱动能力[20]。在XL4015芯片外加LM358运放电路,利用LM358的输出控制XL4015的输出,利用XL4015的FB脚反馈控制输出电压,改变了原有电位器控制电压输出的方式,控制MCU电压输出[21]。电路板上LM317电路为一个线性稳压电路,将输入的12 V电压稳压输出为3.3 V,给主控芯片、LM358供电。设计的LED驱动电路如图8所示。
图8 PWM型LED驱动电路
Fig.8 Driver circuit of PWM typed LED
为了探究锂电池输出电压对LED的影响,利用万用表测试不同电压下的LED电流。当LED驱动电路的供电电压在12～24 V范围内波动时,LED的工作电压稳定在6.5 V(图9a),测得电流为700 mA(图9b)。
图9 LED驱动验证和装置采集信号稳定性曲线
Fig.9 Verification of LED and signal acquisition stability of device
同时,LED连续工作60 min的电流稳定性较好(图9c)。以上结果表明设计的LED驱动方案可行[22]。另外,在连续的LED开关下,检测装置的光电流基本不变(图9d),表明研制的检测装置采集信号的稳定性较好。
1.3.4 便携式检测装置集成及OTC检测试验
将LED及LED驱动电路、SPE基传感器、供电电源和BIOSYS电化学工作站集成,研制的便携式PEC检测装置实物如图10所示。其中,LED为检测提供光源;LED驱动电路可控制LED的定时开关;SPE传感器和BIOSYS电化学工作站用于传感信号的产生及采集;供电电源为LED及其驱动电路供电。
图10 便携式PEC检测装置实物图
Fig.10 Physical diagram of portable PEC detection device
1.LED光源 2.SPE传感器 3.BIOSYS便携式电化学工作站 4.LED驱动电路 5.供电电源
利用研制的便携式检测装置,研究不同浓度OTC对传感器光电流的影响规律。由图11a可知,随着OTC浓度的逐渐增加,由于OTC与适配体的结合增大了传感界面的空间位阻[23],传感器光电流逐渐减小。在浓度范围1×10-8～1×10-6 mol/L内,传感器光电流I与OTC的浓度COTC呈现良好的线性关系(图11b),线性方程为I=-1.64COTC+2.08(R2=0.996),检出限为5.33×10-9 mol/L。
图11 检测装置检测OTC结果
Fig.11 Results for OTC detection by detection device
为了验证研制的便携式提取-检测装置在实际应用中的可行性,对江苏省镇江市某地土壤中的OTC含量进行现场分析。试验流程如图12所示,土壤取样,称取土壤并与萃取液混合,得到土壤混悬液,搅拌混悬液,离心获得土壤提取液,对土壤提取液进行OTC浓度的检测。最后,将检测信号代入线性回归方程,通过计算获得OTC浓度信息。
图12 土壤OTC的现场提取-检测过程
Fig.12 On-site extraction-detection of OTC in soil
装置现场检测土壤OTC试验结果如表2所示。由表2可知,对于未加标OTC的原始土壤样品,使用研制的装置和国标GB/T 32951—2016中的方法UPLC-MS/MS均未检测出OTC,表明土壤样品中不含或含有极少量的OTC。对于不同浓度OTC加标的土壤样品,其OTC检测回收率为92%～97%,相对误差在3%～8%之间,相对标准偏差(RSD)在1.8%～5.2%之间,表明研制的装置可用于土壤OTC的现场精准分析。
表2 不同方法检测结果对比
Tab.2 Detection results of different methods
添加量/(mol·L-1)现场分析方法UPLC-MS/MS检出量/(mol·L-1)回收率/%相对误差/%相对标准偏差/%检出量/(mol·L-1)回收率/%0----5×10-84.6×10-89283.55.1×10-81022×10-71.9×10-79551.81.9×10-7951×10-69.7×10-79735.29.2×10-792
注:“-”表示未检出。
为了验证本文研制的装置对于土壤中OTC检测的可靠性,进一步使用国标GB/T 32951—2016中的方法UPLC-MS/MS对不同OTC加标浓度的土壤样品进行检测,其结果如表2所示。结果表明,UPLC-MS/MS对于不同加标样品的检测回收率在92%～102%之间,且其检测结果与研制的便携式装置的检测结果基本吻合,表明本文研制的装置对于土壤OTC的提取与检测具有较好的准确度,进一步表明本文提出的基于便携式提取-检测装置的现场方法对于土壤中OTC的检测具有较高的可靠性。
基于集成电路技术研制了便携式提取-检测装置,实现了土壤OTC的现场提取与精准分析。利用电子电路技术和3D建模软件,构建了集搅拌、离心、称量功能于一体的便携式提取装置,并利用UPLC-MS/MS对研制装置提取土壤OTC的效率进行验证;为了实现土壤OTC的现场检测,基于集成式SPE制备PEC适配体传感器,分别以LED、便携式电化学工作站为检测装置的光源驱动和信号采集器,研制了一种便携式PEC检测装置,并对装置的分析性能进行考察;最后,将研制的便携提取装置与检测装置结合,提出兼具提取与检测能力的土壤OTC现场分析方法。研制的装置对OTC检测线性范围为1×10-8～1×10-6 mol/L,检出限为5.33×10-9 mol/L,对于实际土壤样品中OTC检测加标回收率为92%～97%。最后,利用国标法UPLC-MS/MS对研制装置提取和检测土壤OTC的准确度进行验证,对比发现,研制装置与UPLC-MS/MS的检测结果基本吻合,表明本文研制的便携式装置对于土壤OTC的现场提取与检测具有较高的准确度和可靠性。
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